วิธีการวิจัยทางอณูชีววิทยามีบทบาทสำคัญในการแพทย์แผนปัจจุบัน นิติเวช และชีววิทยา ต้องขอบคุณความก้าวหน้าในการศึกษา DNA และ RNA ที่ทำให้บุคคลสามารถศึกษาจีโนมของสิ่งมีชีวิต ระบุสาเหตุของโรค รับรู้กรดนิวคลีอิกที่ต้องการในส่วนผสมของกรด เป็นต้น
วิธีวิจัยทางอณูชีววิทยา. มันคืออะไร?
ย้อนกลับไปในยุค 70 และ 80 นักวิทยาศาสตร์สามารถถอดรหัสจีโนมมนุษย์ได้สำเร็จเป็นครั้งแรก เหตุการณ์นี้เป็นแรงผลักดันให้เกิดการพัฒนาพันธุวิศวกรรมและอณูชีววิทยา การศึกษาคุณสมบัติของ DNA และ RNA ได้นำไปสู่ความจริงที่ว่าตอนนี้สามารถใช้กรดนิวคลีอิกเหล่านี้เพื่อวินิจฉัยโรคศึกษายีนได้
รับ DNA และ RNA
วิธีการวินิจฉัยทางอณูชีววิทยาจำเป็นต้องมีสารตั้งต้น: บ่อยกว่านั้นคือกรดนิวคลีอิก มีหลายวิธีในการแยกสารเหล่านี้ออกจากเซลล์ของสิ่งมีชีวิต แต่ละคนมีข้อดีและข้อเสียของตัวเองและจำเป็นพิจารณาเมื่อเลือกวิธีการแยกกรดนิวคลีอิกบริสุทธิ์
1. ได้รับ DNA ตาม Marmur วิธีการนี้ประกอบด้วยการบำบัดส่วนผสมของสารที่มีแอลกอฮอล์ซึ่งเป็นผลมาจากการตกตะกอนของ DNA บริสุทธิ์ ข้อเสียของวิธีนี้คือการใช้สารที่มีฤทธิ์รุนแรง ได้แก่ ฟีนอลและคลอโรฟอร์ม
2. การแยก DNA ตามบูม สารหลักที่ใช้ในที่นี้คือ กัวนิดีน ไทโอไซยาเนต (GuSCN) มันก่อให้เกิดการตกตะกอนของกรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิกบนพื้นผิวพิเศษซึ่งสามารถรวบรวมได้ในภายหลังโดยใช้บัฟเฟอร์พิเศษ อย่างไรก็ตาม GuSCN เป็นตัวยับยั้ง PTC และแม้แต่ส่วนเล็ก ๆ ของมันที่เข้าไปใน DNA ตกตะกอนก็สามารถส่งผลกระทบต่อกระบวนการของปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส ซึ่งมีบทบาทสำคัญในการทำงานกับกรดนิวคลีอิก
3. การตกตะกอนของสิ่งสกปรก วิธีการนี้แตกต่างจากวิธีก่อนหน้านี้ตรงที่มันไม่ใช่โมเลกุลของกรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิกที่ตกตะกอน แต่เป็นสิ่งสกปรก ในการทำเช่นนี้จะใช้เครื่องแลกเปลี่ยนไอออน ข้อเสียคือสารบางชนิดไม่สามารถตกตะกอนได้
4. การตรวจคัดกรองจำนวนมาก วิธีนี้ใช้ในกรณีที่ไม่ต้องการข้อมูลที่แน่นอนเกี่ยวกับองค์ประกอบของโมเลกุลดีเอ็นเอ แต่จำเป็นต้องได้รับข้อมูลทางสถิติ สิ่งนี้อธิบายได้จากข้อเท็จจริงที่ว่าโครงสร้างของกรดนิวคลีอิกอาจเสียหายได้เมื่อบำบัดด้วยผงซักฟอก โดยเฉพาะด่าง
การจำแนกวิธีวิจัย
วิธีการวิจัยทางอณูชีววิทยาทั้งหมดแบ่งออกเป็นสามกลุ่มใหญ่:
1. การขยาย (ใช้เอนไซม์หลายชนิด) ที่นี่หมายถึง PCR - ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสซึ่งมีบทบาทสำคัญในวิธีการวินิจฉัยหลายวิธี
2. ไม่ขยายสัญญาณ วิธีการกลุ่มนี้เกี่ยวข้องโดยตรงกับการทำงานของส่วนผสมของกรดนิวคลีอิก ตัวอย่างคือ 3 blots, in situ hybridization เป็นต้น
3. วิธีการขึ้นอยู่กับการรับรู้สัญญาณจากโมเลกุลของโพรบที่จับกับโพรบ DNA หรือ RNA ที่เฉพาะเจาะจง ตัวอย่างคือ Hybride Capture System (hc2)
เอนไซม์ที่ใช้ในการวิจัยทางอณูชีววิทยา
วิธีการวินิจฉัยระดับโมเลกุลหลายวิธีเกี่ยวข้องกับการใช้เอ็นไซม์ที่หลากหลาย ด้านล่างนี้เป็นรายการที่ใช้บ่อยที่สุด:
1. เอ็นไซม์จำกัด - "ตัด" โมเลกุลดีเอ็นเอออกเป็นส่วนที่จำเป็น
2. DNA polymerase - สังเคราะห์โมเลกุลสองสายของกรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิก
3. Reverse transcriptase (revertase) - ใช้เพื่อสังเคราะห์ DNA บนเทมเพลต RNA
4. DNA ligase - รับผิดชอบในการสร้างพันธะฟอสโฟไดสเตอร์ระหว่างนิวคลีโอไทด์
5. Exonuclease - กำจัดนิวคลีโอไทด์ออกจากส่วนปลายของโมเลกุลกรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิก
PCR เป็นวิธีหลักในการขยาย DNA
ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) ถูกนำมาใช้อย่างแข็งขันในชีววิทยาระดับโมเลกุลสมัยใหม่ นี่เป็นวิธีการที่สามารถรับสำเนาจำนวนมากได้จากโมเลกุล DNA ตัวเดียว (ขยายโมเลกุล)
หน้าที่หลักของ PCR:
- การวินิจฉัยโรค;
- โคลนของเซ็กเมนต์ DNA, ยีน
องค์ประกอบต่อไปนี้จำเป็นต้องทำปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส: โมเลกุล DNA เริ่มต้น, DNA polymerase ที่ทนความร้อนได้ (Taq หรือ Pfu), ดีออกซีไรโบนิวคลีโอไทด์ ฟอสเฟต (แหล่งที่มาของเบสไนโตรเจน), ไพรเมอร์ (2 ไพรเมอร์ต่อ 1 โมเลกุลดีเอ็นเอ) และระบบบัฟเฟอร์เอง ซึ่งปฏิกิริยาทั้งหมดเป็นไปได้
PCR ประกอบด้วยสามขั้นตอน: denaturation, primer annealing and elongation
1. การเสื่อมสภาพ ที่อุณหภูมิ 94-95 องศาเซลเซียส พันธะไฮโดรเจนระหว่าง DNA สองสายจะแตกออก และด้วยเหตุนี้ เราจึงได้โมเลกุลสายเดี่ยวสองโมเลกุล
2. ไพรเมอร์อบอ่อน ที่อุณหภูมิ 50-60 องศาเซลเซียส ไพรเมอร์จะติดอยู่ที่ปลายโมเลกุลกรดนิวคลีอิกแบบสายเดี่ยวตามชนิดของการเติมเต็ม
3. การยืดตัว ที่อุณหภูมิ 72 องศา การสังเคราะห์โมเลกุลของกรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิกที่เป็นเกลียวคู่ของลูกสาวจะเกิดขึ้น
ลำดับดีเอ็นเอ
วิธีการวิจัยทางชีววิทยาระดับโมเลกุลมักต้องการความรู้เกี่ยวกับลำดับนิวคลีโอไทด์ในโมเลกุลกรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิก การจัดลำดับจะดำเนินการเพื่อกำหนดรหัสพันธุกรรม การวินิจฉัยระดับโมเลกุลในอนาคตจะขึ้นอยู่กับความรู้ที่ได้จากการจัดลำดับของมนุษย์
การเรียงลำดับประเภทต่อไปนี้มีความโดดเด่น:
- การจัดลำดับ Maxam-Gilbert;
- เรียงลำดับแซงเงอร์
- pyrosequencing;
- นาโนโพเรลำดับ