การดูดกลืนและปล่อยแสงออกมาอีกโดยสื่ออนินทรีย์และอินทรีย์เป็นผลมาจากการเรืองแสงหรือการเรืองแสง ความแตกต่างระหว่างปรากฏการณ์คือความยาวของช่วงเวลาระหว่างการดูดกลืนแสงและการปล่อยกระแสน้ำ ด้วยการเรืองแสง กระบวนการเหล่านี้จะเกิดขึ้นเกือบพร้อม ๆ กัน และมีการเรืองแสงโดยมีความล่าช้าบ้าง
ภูมิหลังทางประวัติศาสตร์
ในปี 1852 นักวิทยาศาสตร์ชาวอังกฤษ Stokes ได้บรรยายถึงการเรืองแสงเป็นครั้งแรก เขาได้บัญญัติศัพท์ใหม่นี้ขึ้นจากการทดลองกับฟลูออร์สปาร์ ซึ่งปล่อยแสงสีแดงเมื่อสัมผัสกับแสงอัลตราไวโอเลต สโตกส์ตั้งข้อสังเกตถึงปรากฏการณ์ที่น่าสนใจ เขาพบว่าความยาวคลื่นของแสงฟลูออเรสเซนต์มักจะยาวกว่าแสงกระตุ้นเสมอ
มีการทดลองหลายครั้งในศตวรรษที่ 19 เพื่อยืนยันสมมติฐาน พวกเขาแสดงให้เห็นว่าตัวอย่างที่หลากหลายเรืองแสงเมื่อสัมผัสกับแสงอัลตราไวโอเลต วัสดุที่รวมถึง คริสตัล เรซิน แร่ธาตุ คลอโรฟิลล์วัตถุดิบยา สารประกอบอนินทรีย์ วิตามิน น้ำมัน การใช้สีย้อมโดยตรงเพื่อการวิเคราะห์ทางชีววิทยาเริ่มขึ้นในปี พ.ศ. 2473
คำอธิบายด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง
วัสดุบางส่วนที่ใช้ในการวิจัยในช่วงครึ่งแรกของศตวรรษที่ 20 มีความเฉพาะเจาะจงมาก ด้วยตัวชี้วัดที่ไม่สามารถทำได้โดยวิธีคอนทราสต์ วิธีการด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงจึงกลายเป็นเครื่องมือสำคัญทั้งในการวิจัยทางชีวการแพทย์และทางชีววิทยา ผลลัพธ์ที่ได้มีความสำคัญไม่น้อยสำหรับวัสดุศาสตร์
กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงมีประโยชน์อย่างไร? ด้วยความช่วยเหลือของวัสดุใหม่ ทำให้สามารถแยกเซลล์ที่มีความจำเพาะสูงและส่วนประกอบใต้กล้องจุลทรรศน์ได้ กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงช่วยให้คุณตรวจจับแต่ละโมเลกุลได้ สีย้อมที่หลากหลายทำให้คุณสามารถระบุองค์ประกอบหลายอย่างได้ในเวลาเดียวกัน แม้ว่าความละเอียดเชิงพื้นที่ของอุปกรณ์จะถูกจำกัดโดยขีดจำกัดการเลี้ยวเบน ซึ่งจะขึ้นอยู่กับคุณสมบัติเฉพาะของตัวอย่าง แต่การตรวจจับโมเลกุลที่อยู่ต่ำกว่าระดับนี้ก็ค่อนข้างเป็นไปได้เช่นกัน ตัวอย่างต่างๆ แสดงการเรืองแสงอัตโนมัติหลังจากการฉายรังสี ปรากฏการณ์นี้ใช้กันอย่างแพร่หลายในอุตสาหกรรมปิโตรวิทยา พฤกษศาสตร์ สารกึ่งตัวนำ
คุณสมบัติ
การศึกษาเนื้อเยื่อสัตว์หรือจุลินทรีย์ที่ทำให้เกิดโรคมักจะซับซ้อนโดยการเรืองแสงอัตโนมัติที่ไม่เฉพาะเจาะจงที่อ่อนแอเกินไปหรือรุนแรงเกินไป อย่างไรก็ตาม ค่าในการวิจัยได้รับการแนะนำเกี่ยวกับวัสดุของส่วนประกอบที่ตื่นเต้นที่ความยาวคลื่นเฉพาะและปล่อยฟลักซ์แสงที่มีความเข้มที่ต้องการ ฟลูออโรโครมทำหน้าที่เป็นสีย้อมที่สามารถยึดติดกับโครงสร้างได้เอง (มองไม่เห็นหรือมองเห็นได้) ในเวลาเดียวกัน มีความโดดเด่นด้วยความสามารถในการคัดเลือกสูงโดยคำนึงถึงเป้าหมายและผลตอบแทนควอนตัม
กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายกับสีย้อมธรรมชาติและสีสังเคราะห์ พวกมันมีโปรไฟล์ความเข้มข้นของการปล่อยและการกระตุ้นที่เฉพาะเจาะจงและมุ่งเป้าไปที่เป้าหมายทางชีวภาพที่เฉพาะเจาะจง
การระบุโมเลกุลแต่ละโมเลกุล
บ่อยครั้งภายใต้สภาวะที่เหมาะสม คุณสามารถลงทะเบียนการเรืองแสงขององค์ประกอบเดียวได้ ในการทำเช่นนี้ จำเป็นต้องตรวจสอบให้แน่ใจว่าสัญญาณรบกวนของเครื่องตรวจจับต่ำและพื้นหลังออปติคัลเพียงพอ โมเลกุลฟลูออเรสซีนสามารถปล่อยโฟตอนได้มากถึง 300,000 โฟตอนก่อนที่จะถูกทำลายเนื่องจากการฟอกสีด้วยแสง ด้วยอัตราการรวบรวมและประสิทธิภาพกระบวนการ 20% พวกเขาสามารถลงทะเบียนในจำนวนประมาณ 60,000
กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง ซึ่งใช้โฟโตไดโอดหิมะถล่มหรือการเพิ่มจำนวนอิเล็กตรอน ทำให้นักวิจัยสามารถสังเกตพฤติกรรมของโมเลกุลแต่ละโมเลกุลเป็นเวลาไม่กี่วินาที และในบางกรณีก็ไม่กี่นาที
ความยากลำบาก
ปัญหาหลักคือการลดสัญญาณรบกวนจากพื้นหลังออปติคัล เนื่องจากวัสดุจำนวนมากที่ใช้ในการสร้างฟิลเตอร์และเลนส์มีการเรืองแสงอัตโนมัติ ความพยายามของนักวิทยาศาสตร์ในระยะเริ่มแรกจึงมุ่งเน้นไปที่การออกส่วนประกอบที่มีการเรืองแสงต่ำ อย่างไรก็ตาม การทดลองต่อมาทำให้เกิดข้อสรุปใหม่ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงที่อิงจากการสะท้อนภายในทั้งหมดได้รับการค้นพบเพื่อให้ได้พื้นหลังที่ต่ำและให้แสงสว่างที่กระตุ้นสูง
กลไก
หลักการของกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงตามการสะท้อนภายในทั้งหมดคือการใช้คลื่นที่สลายตัวอย่างรวดเร็วหรือไม่แพร่กระจาย มันเกิดขึ้นที่ส่วนต่อประสานระหว่างสื่อที่มีดัชนีการหักเหของแสงต่างกัน ในกรณีนี้ ลำแสงจะลอดผ่านปริซึม มีดัชนีการหักเหของแสงสูง
ปริซึมติดกับสารละลายที่เป็นน้ำหรือแก้วที่มีพารามิเตอร์ต่ำ หากลำแสงพุ่งไปที่มุมที่มากกว่าจุดวิกฤต ลำแสงจะสะท้อนออกจากส่วนต่อประสานอย่างสมบูรณ์ ในทางกลับกัน ปรากฏการณ์นี้ทำให้เกิดคลื่นที่ไม่แพร่กระจาย กล่าวคือ สนามแม่เหล็กไฟฟ้าถูกสร้างขึ้นที่แทรกซึมตัวกลางที่มีดัชนีการหักเหของแสงต่ำกว่าที่ระยะห่างน้อยกว่า 200 นาโนเมตร
ในคลื่นที่ไม่แพร่กระจาย ความเข้มของแสงจะค่อนข้างเพียงพอที่จะกระตุ้นฟลูออโรฟอร์ อย่างไรก็ตาม เนื่องจากความลึกที่ตื้นเป็นพิเศษ ปริมาตรจึงมีขนาดเล็กมาก ผลลัพธ์คือพื้นหลังระดับต่ำ
การดัดแปลง
กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงที่อิงจากการสะท้อนภายในทั้งหมดสามารถรับรู้ได้ด้วย epi-illuminationสิ่งนี้ต้องใช้เลนส์ที่มีรูรับแสงที่เป็นตัวเลขเพิ่มขึ้น (อย่างน้อย 1.4 แต่ควรให้ถึง 1.45-1.6) รวมถึงฟิลด์ที่ส่องสว่างเพียงบางส่วนของอุปกรณ์ หลังทำได้ด้วยจุดเล็ก ๆ เพื่อความสม่ำเสมอมากขึ้นจะใช้วงแหวนบาง ๆ ซึ่งส่วนหนึ่งของการไหลจะถูกปิดกั้น เพื่อให้ได้มุมวิกฤตหลังจากที่เกิดการสะท้อนทั้งหมด จำเป็นต้องมีการหักเหของแสงในระดับสูงของตัวกลางที่แช่ในเลนส์และกระจกครอบกล้องจุลทรรศน์จึงเป็นสิ่งจำเป็น
