แกรมสเตนใช้กันอย่างแพร่หลายในด้านจุลชีววิทยา เนื่องจากเป็นวิธีที่ง่ายที่สุดวิธีหนึ่งในการแยกแยะแบคทีเรียตามองค์ประกอบของผนังเซลล์ของพวกมัน ตามกรัมแบคทีเรียทั้งหมดสามารถแบ่งออกเป็นแกรมบวก (Gram (+)) และแกรมลบ (Gram (-)) วิธีการย้อมแกรมได้รับการพัฒนาในปี พ.ศ. 2427 และไม่สูญเสียความนิยมตั้งแต่นั้นมา แม้ว่าจะมีการปรับเปลี่ยนหลายครั้ง
โครงสร้างผนังเซลล์
การย้อมแกรมแสดงให้เห็นว่าแบคทีเรียเป็นแกรมบวกหรือแกรมลบ การแบ่งแบคทีเรียออกเป็น Gram (+) และ Gram (-) ดำเนินการตามโครงสร้างของผนังเซลล์ของแบคทีเรีย
ผนังเซลล์มี peptidoglycan (murein) จำนวนมากที่สุด - สารที่ซับซ้อนซึ่งรวมถึง peptapeptide และ glycan ไกลแคนประกอบด้วยสารตกค้างสลับกันของ N-acetylglucosamine และกรด N-acetylmuramic ที่เชื่อมโยงกันโดย β-1พันธะ 4-ไกลโคซิดิก Peptidoglycan ให้การบำรุงรูปร่างของเซลล์ การป้องกันการดูดซึม และการทำงานของแอนติเจน
ความแตกต่างหลักระหว่างแบคทีเรียแกรมบวกและแกรมลบ
แบคทีเรียต่างกันมีชั้น peptidoglycan ต่างกัน ในแบคทีเรียที่จัดเป็นแกรมบวก จะมีช่วงตั้งแต่ 15 ถึง 80 นาโนเมตร ในขณะที่แกรมลบจะอยู่ที่ 2 ถึง 8 นาโนเมตร ในเวลาเดียวกัน แบคทีเรียแกรมลบมีโครงสร้างพิเศษภายใต้ชั้น peptidoglycan ซึ่งแบคทีเรียแกรมบวกไม่มี - พื้นที่ periplasmic พื้นที่นี้เต็มไปด้วยเอนไซม์ไฮโดรไลติก - β-lactamase, ribonuclease 1, phosphatase เอนไซม์เหล่านี้มีหน้าที่ในการต้านทานแบคทีเรียแกรมลบต่อยาปฏิชีวนะหลายชนิด
ชั้นแบคทีเรียแกรม(-) peptidoglycan จับกับ lipopolysaccharide ซึ่งเป็นโครงสร้างแอนติเจนที่มีสารเอนโดทอกซิน ในแบคทีเรียแกรม(+) กรดเทโชอิกทำหน้าที่คล้ายคลึงกัน
แบคทีเรียแกรมลบมีโครงสร้างเพิ่มเติม - เยื่อหุ้มชั้นนอก
สาระสำคัญของวิธีการย้อมสี
ก่อนเริ่มย้อมสี แบคทีเรียที่ศึกษาได้เตรียมรอยเปื้อนไว้ เมื่อต้องการทำเช่นนี้ น้ำจะหยดลงบนสไลด์แก้วและมีการเติมเชื้อจุลินทรีย์ที่นั่นด้วยห่วงของแบคทีเรีย จากนั้นหลังจากที่น้ำแห้งสนิท สเมียร์จะได้รับการแก้ไข - เลื่อนกระจกไปเหนือเปลวไฟของเตาหลาย ๆ ครั้ง การย้อมแกรมมีประสิทธิภาพมากกว่าการย้อมสีแบคทีเรียที่มีชีวิต - โมเลกุลของสีย้อมจับกับเซลล์ที่ตายแล้วได้ดีกว่า
การระบายสีทำได้หลายขั้นตอน:
- กระดาษกรองชิ้นเล็กๆ วางบนป้ายที่ตายตัวและสีหลักถูกเทลงไป - เจนเชียนไวโอเลตหรือเมทิลีนบลู
- หลังจาก 3-5 นาที นำกระดาษกรองสีออกแล้วเติมสารละลาย Lugol ลงไป 1 นาที ในกรณีนี้การเตรียมจะมืดลง
- สารละลาย Lugol ถูกระบายออกและสเมียร์จะถูกบำบัดด้วยเอทิลแอลกอฮอล์บริสุทธิ์: หยดสองสามหยดลงบนสารเตรียม ระบายออกหลังจาก 20 วินาที ขั้นตอนทำซ้ำ 2-3 ครั้ง
- ล้างสไลด์ทดสอบด้วยน้ำกลั่น
- ทำสีเพิ่ม - เตรียมฟูชินให้เสร็จ หลังจาก 1-2 นาที สีย้อมจะถูกชะล้างออก
- หลังจากน้ำแห้ง ตรวจดูรอยเปื้อนใต้กล้องจุลทรรศน์ แบคทีเรียแกรมบวกจะเป็นสีน้ำเงินอมม่วง แบคทีเรียแกรมลบจะเป็นสีชมพูหรือสีแดง
สาเหตุของการย้อมสีแบบต่างๆ
ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น การย้อมด้วยแกรมของแบคทีเรียทำให้เกิดคราบแบคทีเรียแกรมบวกเป็นสีน้ำเงินอมม่วง ในขณะที่แบคทีเรียแกรมลบจะย้อมเป็นสีแดงหรือสีชมพู สาเหตุของการย้อมสีดิฟเฟอเรนเชียลของแบคทีเรียด้วยวิธีนี้ก็คือหลังจากที่เจนเชียน ไวโอเล็ตในรูปแบบที่ละลายน้ำได้เข้าสู่เซลล์แล้ว สีย้อมจะผ่านเข้าสู่รูปแบบไอโอดีนที่ไม่ละลายน้ำ ในระหว่างการรักษาแบคทีเรียด้วยเอทิลแอลกอฮอล์ ไขมันจะถูกสกัดจากเมมเบรนภายใต้การกระทำของตัวทำละลายที่ไม่มีขั้วนี้ เมมเบรนจะกลายเป็นรูพรุนและไม่เป็นอุปสรรคสำคัญในการชะล้างสีย้อมอีกต่อไป อย่างไรก็ตามpeptidoglycan มีความทนทานต่อตัวทำละลายที่ไม่มีขั้วรวมถึงแอลกอฮอล์ เขาเป็นคนที่ป้องกันการชะล้างของสีย้อม ดังนั้นแบคทีเรียที่มีชั้นมูรินหนาจึงเปลี่ยนเป็นสีน้ำเงินอมม่วง (แกรมบวก) และหลังจากการรักษาด้วยแอลกอฮอล์แล้ว แบคทีเรียจะไม่เปลี่ยนสี
แบคทีเรียแกรมลบชั้นบางๆ ไม่สามารถจับโมเลกุลของสีย้อมในเซลล์ได้ ดังนั้นหลังจากแอลกอฮอล์ออกฤทธิ์แล้ว แบคทีเรียจะกลายเป็นสีไร้สี - คราบแกรมลบ
หลังจากสัมผัสฟูชิน แบคทีเรียที่ย้อมแกรมยังคงเป็นสีน้ำเงิน-ม่วง ในขณะที่แบคทีเรียแกรมลบจะกลายเป็นสีชมพู-แดง
ตัวอย่างแบคทีเรียแกรม(+) และแกรม(-)
แบคทีเรียแกรมลบ ได้แก่ ไซยาโนแบคทีเรีย แบคทีเรียกำมะถัน แบคทีเรียเหล็ก คลามัยเดีย ริกเค็ตเซีย แบคทีเรียอะซิติก เมทิลโลแบคทีเรียหลายชนิด แบคทีเรียไทโอนิก อาร์เซนิโตแบคทีเรีย คาร์บอกซีแบคทีเรีย
ไบฟิโดแบคทีเรีย, แบคทีเรียในน้ำ, สเตรปโตค็อกซี และสแตปฟิโลคอคซี ถือเป็นแกรมบวก