อะไรรองรับการผสมพันธุ์ของ DNA? แม้ว่าโดยทั่วไปแล้วลำดับ DNA แบบสองสายจะมีความเสถียรภายใต้สภาวะทางสรีรวิทยา แต่การเปลี่ยนแปลงเงื่อนไขเหล่านี้ในห้องปฏิบัติการ (โดยปกติโดยการเพิ่มอุณหภูมิแวดล้อม) จะทำให้โมเลกุลแยกออกเป็นแต่ละเส้น หลังเป็นส่วนเสริมซึ่งกันและกัน แต่อาจเสริมลำดับอื่น ๆ ที่มีอยู่ในสภาพแวดล้อมด้วย การลดอุณหภูมิแวดล้อมทำให้โมเลกุลที่เป็นเกลียวเดี่ยวสามารถหลอมหรือ "ไฮบริไดซ์" ซึ่งกันและกันได้ นี่คือวิธีการผสมพันธุ์ดีเอ็นเอ
แนวคิดจากมุมมองของอณูชีววิทยา
นักวิทยาศาสตร์ที่เกี่ยวข้องกับการจำลอง DNA และการถอดรหัส DNA เป็น RNA นั้นอาศัยนิวคลีโอไทด์ครอสโอเวอร์และเทคนิคทางอณูชีววิทยา ซึ่งรวมถึงจุดใต้และจุดเหนือ ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) และการผสมข้ามพันธุ์ของ DNA-RNA และวิธีการจัดลำดับส่วนใหญ่
แอปพลิเคชัน
ไฮบริดเป็นคุณสมบัติหลักของนิวคลีโอไทด์ลำดับและใช้ในวิธีการต่าง ๆ ของอณูชีววิทยา ความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมโดยรวมของทั้งสองสปีชีส์สามารถกำหนดได้โดยการแบ่งส่วนของดีเอ็นเอของพวกมัน (DNA-DNA hybridization) เนื่องจากลำดับความคล้ายคลึงกันระหว่างสิ่งมีชีวิตที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิด ต้องใช้อุณหภูมิที่สูงขึ้นในการละลายดีเอ็นเอลูกผสมดังกล่าวเมื่อเปรียบเทียบกับสิ่งมีชีวิตที่อยู่ห่างไกลกว่า วิธีการต่างๆ ใช้ไฮบริไดเซชันเพื่อระบุที่มาของตัวอย่างดีเอ็นเอ ซึ่งรวมถึงปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) ในอีกวิธีหนึ่ง ลำดับดีเอ็นเอแบบสั้นถูกไฮบริไดซ์กับ mRNA ของเซลล์เพื่อระบุยีนที่แสดงออก บริษัทยากำลังสำรวจการใช้แอนติเซนส์ RNA เพื่อจับกับ mRNA ที่ไม่ต้องการ ป้องกันไม่ให้ไรโบโซมแปล mRNA เป็นโปรตีน
DNA-DNA hybridization โดยทั่วไปหมายถึงเทคนิคอณูชีววิทยาที่วัดระดับของความคล้ายคลึงทางพันธุกรรมระหว่างกลุ่มของลำดับดีเอ็นเอ มักใช้เพื่อกำหนดระยะห่างทางพันธุกรรมระหว่างสิ่งมีชีวิตทั้งสอง มีการใช้กันอย่างแพร่หลายในสายวิวัฒนาการและอนุกรมวิธาน
วิธีการ
DNA จากสิ่งมีชีวิตตัวหนึ่งถูกติดฉลาก จากนั้นผสมกับ DNA ที่ไม่มีฉลากซึ่งสามารถเปรียบเทียบได้ ของผสมถูกบ่มเพื่อให้สาย DNA แยกตัวออกและจากนั้นทำให้เย็นลงเพื่อสร้าง DNA สายคู่แบบไฮบริดที่สร้างใหม่ ลำดับลูกผสมที่มีความคล้ายคลึงกันในระดับสูงจะเกาะติดกันแน่นขึ้นและต้องการพลังงานมากขึ้นในการแยกออก กล่าวคือ แยกออกเมื่อได้รับความร้อนที่สูงกว่าอุณหภูมิมากกว่าลำดับที่แตกต่างกัน กระบวนการที่เรียกว่า "การละลายของดีเอ็นเอ"
ดีเอ็นเอละลาย
การประเมินโปรไฟล์การหลอมละลายของ DNA แบบลูกผสมนั้น DNA แบบสองสายจะถูกผูกไว้กับสิ่งที่เรียกว่า "คอลัมน์" และส่วนผสมที่ได้จะถูกทำให้ร้อน ในแต่ละขั้นตอน คอลัมน์จะถูกล้างและลำดับดีเอ็นเอที่หลอมละลายกลายเป็นเกลียวเดี่ยวและล้างออกคอลัมน์ อุณหภูมิที่ DNA ติดฉลากออกจากคอลัมน์สะท้อนถึงปริมาณความคล้ายคลึงกันระหว่างลำดับ (และรูปแบบการพับตัวเองทำหน้าที่เป็นตัวควบคุม) ผลลัพธ์เหล่านี้ถูกนำมารวมกันเพื่อกำหนดระดับของความคล้ายคลึงกันทางพันธุกรรมระหว่างสิ่งมีชีวิต ตามจุลชีววิทยาสมัยใหม่ การผสมพันธุ์ของ DNA เป็นไปไม่ได้หากไม่เข้าใจสิ่งเหล่านี้
เมื่อเปรียบเทียบกรดไรโบนิวคลีอิกหลายสายพันธุ์ (หรือดีออกซีไรโบนิวคลีอิก) ด้วยวิธีนี้ ค่าความคล้ายคลึงกันจะอนุญาตให้วางสปีชีส์ในต้นไม้สายวิวัฒนาการ ดังนั้น นี่จึงเป็นหนึ่งในแนวทางที่เป็นไปได้ในการดำเนินการจัดระบบระดับโมเลกุล Charles Sibley และ John Ahlquist ผู้บุกเบิกเทคนิคนี้ ใช้การผสมพันธุ์ DNA-DNA เพื่อศึกษาความสัมพันธ์ทางสายวิวัฒนาการของนก (อนุกรมวิธาน Sibley-Ahlquist) และไพรเมต
ความสำคัญต่อชีววิทยา
DNA-DNA hybridization เป็นมาตรฐานทองคำในการจำแนกชนิดของแบคทีเรีย โดยมีค่าความคล้ายคลึงกันมากกว่า 70% ซึ่งบ่งชี้ว่าสายพันธุ์ที่เปรียบเทียบนั้นเป็นของสายพันธุ์ที่ต่างกัน ในปี 2014 มีการเสนอเกณฑ์ความคล้ายคลึงกัน 79% เพื่อแยกสายพันธุ์ย่อยของแบคทีเรีย
นักวิจารณ์โต้แย้งว่าเทคนิคนี้ไม่ถูกต้องสำหรับการเปรียบเทียบสปีชีส์ที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิด เนื่องจากความพยายามใดๆ ในการวัดความแตกต่างระหว่างลำดับออร์โธโลกัสระหว่างสิ่งมีชีวิตถูกครอบงำด้วยการผสมพันธุ์ของคู่ Paralogous ในจีโนมของสิ่งมีชีวิต การเปรียบเทียบลำดับดีเอ็นเอและการเปรียบเทียบลำดับการคำนวณเป็นวิธีที่ใช้กันทั่วไปในการกำหนดระยะห่างทางพันธุกรรม ถึงแม้ว่าวิธีการนี้จะยังคงใช้ในจุลชีววิทยาเพื่อช่วยระบุแบคทีเรีย
วิธีการในปัจจุบันคือการทำ DNA-DNA hybridization ในซิลิโคนโดยใช้จีโนมที่มีลำดับทั้งหมดหรือบางส่วน GGDC ที่พัฒนาโดย DSMZ เป็นเครื่องมือที่รู้จักที่แม่นยำที่สุดสำหรับการคำนวณค่าที่เหมือน DDH ในบรรดาการปรับปรุงอัลกอริธึมอื่น ๆ มันแก้ปัญหาด้วยลำดับ Paralogous โดยการกรองพวกมันออกจากการจับคู่ระหว่างสองลำดับจีโนมอย่างระมัดระวัง
วิธีตกปลา
Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) เป็นเทคนิคในห้องปฏิบัติการที่ใช้ในการตรวจหาและจัดลำดับ DNA ซึ่งมักจะอยู่บนโครโมโซมเฉพาะ
ในปี 1969 โจเซฟ กัลล์และแมรี่ ลู ปาร์ดูตีพิมพ์บทความที่แสดงให้เห็นว่าสำเนากัมมันตภาพรังสีของลำดับดีเอ็นเอของไรโบโซมสามารถนำมาใช้ในการตรวจจับลำดับดีเอ็นเอเสริมในนิวเคลียสของไข่กบ เนื่องจากการสังเกตดั้งเดิมเหล่านี้ การปรับแต่งหลายอย่างได้เพิ่มความเก่งกาจและความไวของขั้นตอนจนถึงขอบเขตที่การผสมพันธุ์แบบ in situ ("in place", Latin) ถือเป็นเครื่องมือสำคัญในเซลล์พันธุศาสตร์ (ปัจจุบันคำว่า in situ ใช้เพื่ออ้างถึงระยะเริ่มต้นของการเติบโตของมะเร็งด้วย เมื่อมีเพียงเนื้อเยื่อเยื่อบุผิวเท่านั้นที่เกี่ยวข้องในกระบวนการทางพยาธิวิทยา)
ลำดับการผสมพันธุ์ของฟลูออเรสเซนต์
RNA probes สามารถออกแบบสำหรับยีนใดๆ หรือลำดับใดๆ ภายในยีนเพื่อให้เห็นภาพ lncRNA และ miRNA mRNA ในเนื้อเยื่อและเซลล์ FISH ถูกใช้โดยการศึกษาวัฏจักรของการสืบพันธุ์ของเซลล์ โดยเฉพาะช่วงระหว่างนิวเคลียสสำหรับความผิดปกติของโครโมโซม FISH ช่วยให้คุณวิเคราะห์ชุดเอกสารสำคัญต่างๆ ได้ ซึ่งง่ายต่อการระบุโครโมโซมที่ระบุโดยการสร้างโพรบที่มีฐานโครโมโซมเทียมที่จะดึงดูดโครโมโซมที่คล้ายกัน
สัญญาณไฮบริไดเซชันสำหรับโพรบแต่ละตัวเมื่อตรวจพบความผิดปกติของนิวเคลียร์: โพรบตรวจจับ mRNA และ lncRNA แต่ละตัวประกอบด้วยโอลิโกนิวคลีโอไทด์ 20 คู่ แต่ละคู่ครอบคลุมพื้นที่ 40-50 bp p. โพรบใช้เคมีที่เป็นกรรมสิทธิ์ในการตรวจจับ mRNA
ไฮบริดด้วยโพรบดีเอ็นเอ
โพรบมักทำจากชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ถูกแยกออก ทำให้บริสุทธิ์ และขยายออกเพื่อใช้ในการออกแบบจีโนมมนุษย์ ขนาดของจีโนมมนุษย์นั้นใหญ่มากเมื่อเทียบกับความยาวที่สามารถจัดลำดับได้โดยตรงจึงจำเป็นต้องแบ่งออกเป็นเศษ ในท้ายที่สุด ชิ้นส่วนเหล่านี้ได้รับคำสั่งโดยการย่อยสำเนาของแต่ละชิ้นส่วนเป็นหน่วยที่เล็กกว่าโดยใช้เอนโดนิวคลีเอสเฉพาะลำดับเพื่อวัดขนาดของแต่ละชิ้นส่วนขนาดเล็กโดยใช้โครมาโตกราฟีการแยกขนาดโดยใช้ข้อมูลนี้เพื่อกำหนดว่าชิ้นส่วนขนาดใหญ่ซ้อนทับกันที่ใด.
เพื่อรักษาองค์ประกอบด้วยลำดับ DNA ของพวกมัน ชิ้นส่วนเหล่านี้จึงถูกเพิ่มเข้าไปในระบบของประชากรแบคทีเรียที่ทำซ้ำๆ แบคทีเรียโคลนอลแต่ละกลุ่มมีโครโมโซมเทียมเพียงตัวเดียว ถูกเก็บไว้ในห้องปฏิบัติการต่างๆ ทั่วโลก โครโมโซมประดิษฐ์ (BAC) สามารถปลูก สกัด และติดฉลากในห้องปฏิบัติการใดๆ ที่มีห้องสมุด ห้องสมุดจีโนมมักตั้งชื่อตามสถาบันที่พัฒนาขึ้น ตัวอย่างคือห้องสมุด RPCI-11 ซึ่งตั้งชื่อตามสถาบันมะเร็งรอสเวลในบัฟฟาโล (นิวยอร์ก สหรัฐอเมริกา) ชิ้นส่วนเหล่านี้ประกอบขึ้นเป็นคู่เบสประมาณ 100,000 คู่และเป็นพื้นฐานของโพรบ FISH ส่วนใหญ่
